2024年8月，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院Paola Picotti團(tuán)隊(duì)在期刊Nat Chem Biol（IF=12.9）上發(fā)表了題為“In situ analysis of osmolyte mechanisms of proteome thermal stabilization”的研究論文，該研究創(chuàng)新性地結(jié)合TPP和LiP-MS深入剖析滲透劑在細(xì)胞內(nèi)如何調(diào)控蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性。研究不僅揭示了滲透劑對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的深遠(yuǎn)影響，還闡明了它們?cè)诙鄻踊瘻囟拳h(huán)境下對(duì)蛋白質(zhì)保護(hù)及聚集行為的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，為生物技術(shù)領(lǐng)域和藥物開(kāi)發(fā)中有效利用這些天然分子開(kāi)辟了新思路和策略。

滲透機(jī)制

滲透機(jī)制是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化的關(guān)鍵策略之一。滲透劑如甜菜堿和三甲胺-N-氧化物（TMAO）在細(xì)胞中積累，幫助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化，影響蛋白質(zhì)聚集，對(duì)心血管疾病研究至關(guān)重要。體外研究表明滲透物能夠熱穩(wěn)定蛋白，但機(jī)制仍有爭(zhēng)議，并在細(xì)胞環(huán)境中缺乏系統(tǒng)的研究。LiP-MS可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的聚集變化，但是LiP-MS數(shù)據(jù)本身無(wú)法明確區(qū)分聚集與其它導(dǎo)致蛋白酶敏感性降低的結(jié)構(gòu)變化，因此引入了TPP來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的熱誘導(dǎo)聚集來(lái)評(píng)估其熱穩(wěn)定性，從而補(bǔ)充LiP-MS數(shù)據(jù)，為研究提供了更全面的視角。

技術(shù)流程

LiP–MS thermal profiling（LiP-MS+TPP）是將蛋白酶K（PK）添加到暴露于溫度梯度的天然裂解物等分液中，PK可切割蛋白的柔性和可接近區(qū)域，隨著溫度的升高，蛋白聚集，越來(lái)越少的區(qū)域被PK切割，通過(guò)檢測(cè)不同溫度梯度下產(chǎn)生的不同肽段豐度，以產(chǎn)生每種蛋白的熱剖面。

實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、滲透劑對(duì)大腸桿菌蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響

作者首先來(lái)評(píng)估不同滲透劑對(duì)大腸桿菌蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響。通過(guò)將大腸桿菌裂解液暴露于六種不同的滲透劑（包括TMAO、甜菜堿、甘油、脯氨酸、海藻糖和葡萄糖），觀察到這些化學(xué)物質(zhì)如何影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。研究結(jié)果顯示，所有測(cè)試的滲透劑都能在一定程度上提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。其中，TMAO顯示出最強(qiáng)的穩(wěn)定效果，能夠穩(wěn)定大部分檢測(cè)到的蛋白質(zhì)（67.2%），而甘油的穩(wěn)定效果相對(duì)較弱。這些發(fā)現(xiàn)為理解滲透劑如何在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中保護(hù)蛋白質(zhì)免受熱變性提供了新的見(jiàn)解，并可能對(duì)開(kāi)發(fā)新的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化策略具有重要意義。

滲透劑對(duì)大腸桿菌蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響

二、滲透劑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集溫度上移來(lái)抵抗蛋白沉降

實(shí)驗(yàn)觀察到所有測(cè)試滲透劑均促使蛋白質(zhì)聚集的溫度閾值上移，這一現(xiàn)象揭示了滲透劑通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有效延遲了蛋白質(zhì)的聚集過(guò)程。

滲透劑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集溫度上移來(lái)抵抗蛋白沉降

三、滲透劑通過(guò)優(yōu)先排斥機(jī)制穩(wěn)定蛋白

該研究利用HEK293T細(xì)胞模型，采用LiP–MS thermal profiling深入分析多種滲透劑對(duì)人類蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)滲透劑主要通過(guò)優(yōu)先排斥機(jī)制來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)，即滲透劑與蛋白質(zhì)相互排斥，使得蛋白質(zhì)更傾向于保持其緊密折疊的狀態(tài)，從而在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。此外，還發(fā)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)可能通過(guò)與滲透劑的直接結(jié)合來(lái)增強(qiáng)熱穩(wěn)定性。

滲透劑通過(guò)優(yōu)先排斥機(jī)制穩(wěn)定蛋白

四、TMAO滲透劑的特異性效應(yīng)

盡管多數(shù)滲透劑對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用具有普遍性，但特定滲透劑如TMAO對(duì)有結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和無(wú)序蛋白質(zhì)的影響存在差異，能夠穩(wěn)定球狀蛋白質(zhì)同時(shí)促進(jìn)大型無(wú)序蛋白質(zhì)的聚集。

TMAO滲透劑的特異性效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

LiP–MS thermal profiling技術(shù)不僅深化了我們對(duì)細(xì)胞借助滲透劑應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還為探究蛋白質(zhì)在多變環(huán)境條件下的穩(wěn)定性與功能活性提供了強(qiáng)有力的分析平臺(tái)。此技術(shù)在藥物研發(fā)領(lǐng)域尤其重要，它有助于篩選和優(yōu)化潛在藥物分子，評(píng)估它們對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及聚集行為的作用，進(jìn)而提升藥物的有效性并降低潛在的副作用風(fēng)險(xiǎn)。

藥物靶點(diǎn)在醫(yī)藥研發(fā)中至關(guān)重要，它們是藥物作用的生物分子，涵蓋蛋白質(zhì)、酶、受體等，對(duì)調(diào)節(jié)生物體的生理和病理過(guò)程起著決定性作用。藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證是新藥研發(fā)的首要步驟，直接關(guān)系到研發(fā)的成敗。青蓮百奧生物科技有限公司專注于臨床需求，以源頭創(chuàng)新為動(dòng)力，利用其專業(yè)平臺(tái)，結(jié)合限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)（LiP-MS）和熱蛋白質(zhì)組學(xué)（TPP），打造了高效的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。這一平臺(tái)不僅加速了藥物篩選過(guò)程，還提高了藥物的療效和安全性，為個(gè)性化醫(yī)療提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pepelnjak M, Velten B, N?pflin N, et al. In situ analysis of osmolyte mechanisms of proteome thermal stabilization [J]. Nature Chemical Biology, 2024, 20(8): 1053-1065.