玉兔搗藥是中國(guó)神話傳說(shuō)故事之一。見(jiàn)于漢樂(lè)府《董逃行》。相傳月亮之中有一只兔子，渾身潔白如玉，所以稱作"玉兔"。這種白兔拿著玉杵，跪地?fù)v藥，成蛤蟆丸，服用此等藥丸可以長(zhǎng)生成仙。久而久之，玉兔便成為月亮的代名詞。
舉頭望明月，低頭做仙方。找到藥靶很重要，實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)很考究。實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間選擇合適才能快速找到藥靶，求得仙方。怎么拿捏這一重要環(huán)節(jié)，求得“煉丹術(shù)”呢？往下看：
這是獲取藥物使用濃度和孵育時(shí)間的直接來(lái)源。一般來(lái)說(shuō)，商品化的藥物說(shuō)明書(shū)上都會(huì)標(biāo)注藥物的貯存濃度、使用濃度以及孵育時(shí)間，我們拿到之后應(yīng)該先看一下廠家怎么說(shuō)~以脂多糖（LPS）刺激免疫細(xì)胞為例，我們查閱說(shuō)明書(shū)可以看到孵育濃度為2 μg/mL，孵育時(shí)間為1~3天?？梢栽诖嘶A(chǔ)上做加減法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)找到適合自己的實(shí)驗(yàn)條件~
脂多糖（LPS）刺激免疫細(xì)胞（數(shù)據(jù)來(lái)源脂多糖（LPS）刺激免疫細(xì)胞-流式實(shí)驗(yàn)-賽默飛 | Thermo Fisher Scientific - CN）
當(dāng)說(shuō)明書(shū)的信息不足以滿足特定樣本類型的需要時(shí)，可以通過(guò)文獻(xiàn)檢索來(lái)找到其他研究者在類似實(shí)驗(yàn)條件下使用的藥物濃度和孵育時(shí)間。以Pumbed為例，輸入藥物及樣本類型，選擇相關(guān)的文章看看前輩們都是怎么做的，以LPS為例，我們輸入“l(fā)ps incubation”和“RAW264.7”，查閱檢索到的文章，篩選適合自己的方案?？梢栽跈z索匯總的結(jié)果的基礎(chǔ)上做加減法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)找到適合自己的實(shí)驗(yàn)條件~
Pumbed文獻(xiàn)檢索
在缺乏文獻(xiàn)指導(dǎo)時(shí)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定藥物的最佳濃度是一種實(shí)用的方法。首先進(jìn)行廣泛的濃度梯度實(shí)驗(yàn)，以識(shí)別藥物活性的大致范圍。然后，根據(jù)初次結(jié)果，選擇一個(gè)更窄的濃度區(qū)間進(jìn)行更精細(xì)的測(cè)試，以縮小最佳濃度范圍。
這其中有兩個(gè)關(guān)鍵衡量指標(biāo)，那就是半最大抑制濃度（IC50）和半最大效應(yīng)濃度（EC50），IC50值是指在藥物濃度-反應(yīng)曲線上能夠抑制50%細(xì)胞活性的濃度；EC50是激活50%靶標(biāo)活性所需的濃度，這是常用的衡量藥物活性的參數(shù)。IC50值和EC50值可以作為初始參考濃度，但需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化。
在設(shè)計(jì)藥物濃度梯度時(shí)，推薦選擇6至10個(gè)濃度點(diǎn)，包括0濃度對(duì)照。這些點(diǎn)應(yīng)等比分布（2,3,4,5,10等），如以2為基數(shù)，則濃度可設(shè)為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6等，系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞的活力，來(lái)探索藥物效果隨劑量變化的關(guān)系。
藥物劑量梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)
藥物濃度效應(yīng)曲線通常呈現(xiàn)S型或反S型，且在IC50/EC50附近變化最為顯著，類似指數(shù)增長(zhǎng)，因此IC50/EC50的計(jì)算通常采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。此外，IC50/EC50值可能因細(xì)胞狀態(tài)不同而波動(dòng)，有時(shí)變化幅度可達(dá)2-5倍，這是實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的現(xiàn)象。
以本圖為例，從圖中可以看到此藥物的IC50為30μg/mL，后續(xù)可以以此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
AS-IV的IC50 實(shí)驗(yàn)[1]
在藥物研究中，孵育時(shí)間的選擇至關(guān)重要，它影響藥物的最終效果。
首先應(yīng)根據(jù)藥物的作用機(jī)制和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行作用時(shí)間的選擇，短期作用時(shí)間通常為幾分鐘至幾小時(shí)，而長(zhǎng)期作用時(shí)間可達(dá)數(shù)天。選擇合適的作用時(shí)間能有效評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及信號(hào)通路的影響。
明確藥物作用機(jī)制、實(shí)驗(yàn)需求以及藥物濃度后，設(shè)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)（如0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)等）可以揭示藥物效應(yīng)的時(shí)間依賴性（類似藥物劑量選擇）。
根據(jù)數(shù)據(jù)繪制藥物效應(yīng)隨時(shí)間變化的曲線，幫助識(shí)別藥物的峰值效應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而確定最佳作用時(shí)間。
在藥物作用評(píng)估中，可以通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)獲取關(guān)鍵數(shù)據(jù)：
1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：
細(xì)胞活力檢測(cè)：MTT和CCK-8等方法用于評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，確保藥物濃度在有效范圍內(nèi)，避免非特異性細(xì)胞死亡。
蛋白和基因表達(dá)分析：使用Western Blot、ELISA和qPCR等技術(shù)檢測(cè)特定靶標(biāo)的表達(dá)，了解藥物對(duì)目標(biāo)通路的影響。
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：熒光標(biāo)記和活細(xì)胞成像可用于實(shí)時(shí)觀察藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的影響。
2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
血藥濃度和藥代動(dòng)力學(xué)：測(cè)定血藥濃度，結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和藥效動(dòng)力學(xué)（PD）來(lái)優(yōu)化藥物劑量和作用時(shí)間。
采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)：根據(jù)藥物半衰期和分布動(dòng)態(tài)選擇適當(dāng)?shù)牟蓸訒r(shí)間點(diǎn)（如給藥后1小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)等），以確定最佳劑量和作用時(shí)間。
這些方法和設(shè)計(jì)有助于全面評(píng)估藥物的效果和優(yōu)化使用條件。
在確定藥物的作用濃度及時(shí)間后也要觀察藥物是否對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了不必要的毒性，可以采用下面方法進(jìn)行探究~
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：在確定藥物有效濃度和作用時(shí)間的同時(shí)，使用MTT、CCK-8、LDH釋放等方法評(píng)估藥物的細(xì)胞毒性，確保藥物濃度不引起過(guò)多非特異性傷害。
凋亡和壞死檢測(cè)：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V/PI染色等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死，評(píng)估藥物是否引發(fā)不希望的細(xì)胞死亡。
小編的分享就到這里啦~希望對(duì)您的科研有幫助！藥物預(yù)實(shí)驗(yàn)不要急，慢慢來(lái)，實(shí)驗(yàn)最需要的就是靜心和耐心~
【參考文獻(xiàn)】
[1] Li D, Li G, Chen Y, et al. Astragaloside IV protects ATDC5 cells from lipopolysaccharide-caused damage through regulating miR-203/MyD88 [J]. Pharmaceutical Biology, 2020, 58(1): 89-97.
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