藥物在不同患者中療效差異顯著，這不僅與基因變異有關，還源于蛋白質層面的微小變化?；蚩赏ㄟ^剪接和翻譯后修飾生成多種蛋白質異構體（Proteoforms），這些異構體直接影響藥物靶向和療效。然而，傳統(tǒng)研究多聚焦單一蛋白質，忽視了異構體的關鍵作用，尤其在無基因突變時，其重要性更為凸顯。要全面理解藥物機制及副作用，亟需精準工具揭示蛋白質異構體的復雜性，為精準醫(yī)學開辟新路徑。
同一蛋白不同異構體（proteoform）對藥物的敏感性差異
伊布替尼（Ibrutinib）是一種用于治療慢性淋巴細胞白血病（CLL）等疾病的布魯頓酪氨酸激酶（BTK）抑制劑。盡管其主要靶點是BTK，但臨床觀察顯示，伊布替尼的療效和毒性可能與多種非靶標作用有關。
熱蛋白質組分析（TPP）通過質譜方法和多溫度點的精細描繪，能夠高通量鑒定藥物靶點和脫靶點，還可以在無先驗知識的前提下區(qū)分變構體的差異（Western Blot需要預先知道目的蛋白的修飾差異）。通過TPP技術，研究者可以在細胞內(nèi)系統(tǒng)性分析伊布替尼可能影響的其他蛋白質形式和生物學過程，從而更全面地揭示其作用機制。
2025年2月25日，熱蛋白質組學開發(fā)者團隊成員，瑞典卡羅林斯卡學院Rozbeh Jafari團隊在期刊Nat Commun（IF=14.7）上發(fā)表了題為“Functional proteoform group deconvolution reveals a broader spectrum of ibrutinib off-targets”的研究論文，該研究利用熱蛋白質組學（TPP）探究伊布替尼治療白血?。–LL）的靶點及脫靶點，并通過蛋白異構體研究揭示了伊布替尼對特定蛋白變體的特異性結合及其生物學效應。這些發(fā)現(xiàn)不僅擴展了對伊布替尼作用機制的理解，還為精準醫(yī)學和藥物開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)和技術支持[1]。
細胞系樣本：RCH-ACV（前體B細胞急性淋巴細胞白血病細胞系）和SW13（腎上腺皮質癌細胞系）的裂解液用于TPP實驗，設置Ibrutinib處理組和DMSO對照組。
CLL樣本：68例CLL患者的外周血臨床樣本用于質譜分析，以評估功能蛋白質形式分組在臨床治療中的變化，設置Ibrutinib治療組和未治療組。
功能性蛋白異構體組分析：通過TPP系統(tǒng)分析ibrutinib的靶點和脫靶點，揭示其廣泛作用機制。
蛋白異構體藥物敏感性差異發(fā)現(xiàn)：ibrutinib對BRAF、YES1的特定異構體組具有特異性結合，揭示更細致的藥物機制。
臨床樣本驗證：在CLL患者中，蛋白異構體組豐度變化（如WASHC2C_1）與治療反應相關，解釋敏感性與耐藥性。
高剪接亞組獨特發(fā)現(xiàn)：在ASB-CLL亞組中，識別與ibrutinib敏感性相關的異構體組（如BZW2_2），為治療策略提供新思路。
通過熱蛋白質組分析（TPP），研究團隊在ibrutinib處理的細胞裂解物中成功識別了16079個功能性蛋白異構體組。這些蛋白異構體組在熱穩(wěn)定性上表現(xiàn)出顯著差異，尤其是在ibrutinib處理與未處理的條件下。研究不僅驗證了ibrutinib的已知靶點，如BTK（Bruton酪氨酸激酶），還發(fā)現(xiàn)了新的潛在靶點，這些靶點涉及高爾基體運輸、糖基化、細胞粘附和內(nèi)體處理等功能。這些新靶點的發(fā)現(xiàn)提示，ibrutinib可能通過這些蛋白異構體組在免疫調節(jié)和細胞過程調控中發(fā)揮更廣泛的作用。
ibrutinib的結合可能引發(fā)蛋白質的構象變化或變構效應，進而改變靶點與其結合伙伴之間的相互作用。通過過度表達分析（ORA），研究團隊識別了多個受ibrutinib影響的蛋白質復合物，包括CORVET、HOPS和NUMAC復合物。這些復合物在細胞中參與多種關鍵過程，如膜運輸、信號傳導和染色質重塑，表明ibrutinib可能通過調控這些復合物的功能來發(fā)揮其生物學效應。
通過分析BRAF和YES1的功能性蛋白異構體組，研究發(fā)現(xiàn)ibrutinib對某些異構體組具有特異性結合。BRAF的兩個異構體組（BRAF_1和BRAF_2）在ibrutinib處理下熱穩(wěn)定性不同，提示其可能以不同構象存在。YES1的兩個異構體組（YES1_1和YES1_2）也表現(xiàn)出不同熱穩(wěn)定性，表明其N端調控區(qū)域（SNRE）可能影響ibrutinib結合。這些結果表明，蛋白異構體組分析能更細致地揭示藥物結合特性，而基因水平分析可能掩蓋這些差異。
通過pull-down實驗，研究團隊驗證了TPP識別的部分ibrutinib靶點，包括WASH復合物的WASHC2C_1、BTK的兩個功能性蛋白異構體組（BTK_1和BTK_2）、src激酶家族成員FYN_1以及RAF激酶家族成員BRAF_1。這些結果進一步證實了功能性蛋白異構體組分析的可靠性，并支持ibrutinib通過影響特定蛋白異構體組來發(fā)揮其生物學效應的假設。
在慢性淋巴細胞白血?。–LL）患者隊列中，研究團隊發(fā)現(xiàn)功能性蛋白異構體組的豐度變化與ibrutinib治療狀態(tài)密切相關。例如，WASHC2C_1在ibrutinib治療的患者中豐度顯著降低，而WASHC2C_2則無明顯變化。這些變化可能揭示了治療敏感性和耐藥性的潛在機制，并提示ibrutinib可能通過調控特定蛋白異構體組的豐度來發(fā)揮其治療效果。
在剪接體活性增強的CLL患者亞組（ASB-CLL）中，研究團隊識別了一些與ibrutinib體外敏感性相關的功能性蛋白異構體組。例如，BZW2_2的豐度與ibrutinib的體外敏感性顯著相關，提示該蛋白異構體組可能在ibrutinib的耐藥性中起關鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于解釋該亞組患者對ibrutinib的較差反應，并為未來的治療策略提供新的思路。
TPP作為高通量檢測蛋白異構體藥物敏感性差異的蛋白質組學工具，揭示了伊布替尼的更廣泛靶點譜，還解析了蛋白質復合物和異構體組的動態(tài)變化。這些發(fā)現(xiàn)為理解藥物的作用機制、優(yōu)化治療方案以及推動精準醫(yī)學的發(fā)展提供了重要的理論依據(jù)和技術支持。
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