咳嗽、發(fā)熱、戴口罩……提起這幾個(gè)敏感詞，你可能第一反應(yīng)想到新冠肺炎。但有一種由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）引起傳染病，比新冠要常見得多，僅憑一己之力，就帶走了全球數(shù)億人的生命，它就是號(hào)稱“白色瘟疫”的結(jié)核?。═B）。

CD8+T細(xì)胞對(duì)主要組織相容性復(fù)合體I類（MHC-I）上呈遞的Mtb特異性肽的識(shí)別有助于對(duì)TB的免疫，但控制Mtb抗原在MHC-I上呈遞的原理尚不完全清楚。來自麻省理工大學(xué)Forest M White和Bryan D Bryson教授團(tuán)隊(duì)的這篇《Immunopeptidomics reveals determinants of Mycobacterium tuberculosis antigen presentation on MHC class I》（eLife， IF=7.7）的研究論文，通過對(duì)Mtb感染的原代人巨噬細(xì)胞MHC-I的免疫肽組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Mtb的VII型分泌系統(tǒng)（T7SS）的底物在MHC-I上過度表達(dá)，并揭示了多種T7SS的活性如何相互作用以促進(jìn)MHC-I上Mtb抗原的呈遞。

文章題目：Immunopeptidomics reveals determinants of Mycobacterium tuberculosis antigen presentation on MHC class I

發(fā)表期刊：eLife

影響因子：7.7

發(fā)表單位：麻省理工大學(xué)

研究策略

實(shí)驗(yàn)材料：原代人單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞；

實(shí)驗(yàn)方案：

1. Mtb（H37Rv）感染原代人巨噬細(xì)胞，感染72h后，通過免疫沉淀法分離MHC-I，分別通過兩種方法10 kDa分子量截止過濾器以及反相C18柱分離純化相關(guān)肽段，采用LC-MS/MS技術(shù)鑒定與MHC-I結(jié)合的肽段，包括Mtb衍生的肽段；

2. 另外使用定量、目標(biāo)化的質(zhì)譜（SureQuant）來量化Mtb肽段在MHC-I上的呈現(xiàn)，并分析ESX-1活性對(duì)這一過程的影響。

圖1 免疫肽組學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖

結(jié)果速遞

一、Mtb感染的巨噬細(xì)胞的MHC-I免疫肽富含T7SS底物

通過免疫肽組學(xué)鑒定MHC-I上所展示的Mtb來源多肽，共鑒定到16種MHC-I肽段，其中13個(gè)（81.25%）來自于T7SS分泌的蛋白。Mtb基因組主要編碼五種類型T7SS（ESX-1，ESX-2，ESX-3，ESX-4和ESX-5），研究發(fā)現(xiàn)MHC-I上的多肽主要來源于其中三種類型（ESX-1，ESX-3，和ESX-5）所分泌的蛋白。研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于多個(gè)T7SS底物，來自同一蛋白質(zhì)中的多個(gè)肽包括EsxA、PPE20、EspC、PE35以及EsxJ家族蛋白質(zhì)（EsxJ、EsxK、EsxP和EsxW）中的保守序列。與整個(gè)Mtb蛋白質(zhì)組相比，T7SS底物在肽段水平和蛋白質(zhì)水平上MHC-I肽段庫(kù)中都過表達(dá)。

圖2 Mtb感染的巨噬細(xì)胞的MHC-I免疫肽富含T7SS底物

二、Mtb需要ESX-1活性來破壞吞噬體膜

為了探究Mtb抗原在巨噬細(xì)胞中如何被處理和加載到MHC-I分子上的可能機(jī)制，使用共聚焦顯微鏡，觀察Mtb在原代人巨噬細(xì)胞內(nèi)的呈遞途徑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分Mtb與Galectin-3和P62共定位，這兩者分別是吞噬體膜通透性和識(shí)別細(xì)胞質(zhì)暴露細(xì)菌的標(biāo)記物。此外，部分Mtb也與晚期內(nèi)質(zhì)體和溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP-1共定位，這表明Mtb可能接觸到內(nèi)溶酶體蛋白酶。然而，Mtb所在的吞噬體并沒有與MHC-I本身共定位，表明Mtb抗原不太可能在含有Mtb的吞噬體內(nèi)被裝載到MHC-I上。這些結(jié)果暗示，進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)是Mtb抗原處理和呈現(xiàn)的可能途徑。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)ESX-1分泌系統(tǒng)活性受損的Mtb菌株在與Galectin-3和P62的共定位減少，表明ESX-1活性對(duì)于Mtb破壞吞噬體膜是必需的。

圖3 Mtb以依賴Esx -1的方式與吞噬體膜損傷標(biāo)記物共定位

三、EsxA28-36和EsxJKPW24-34在MHC-I上呈遞依賴于ESX-1活性

通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)ESX-1介導(dǎo)的吞噬體膜損傷可能是Mtb抗原進(jìn)入MHC-I抗原處理途徑的必要條件。使用定量的靶向質(zhì)譜（SureQuant）方法來測(cè)量不同實(shí)驗(yàn)條件下EsxA28-36和EsxJKPW24-34兩種肽段的呈現(xiàn)情況。研究結(jié)果表明，當(dāng)巨噬細(xì)胞感染缺乏ESX-1的Mtb時(shí)，這兩種肽段都不能在MHC-I上呈現(xiàn)。此外，還進(jìn)一步探索了這種呈現(xiàn)是否依賴于I型干擾素信號(hào)。發(fā)現(xiàn)，添加外源性的IFN-β可以恢復(fù)I型干擾素反應(yīng)，但并不能恢復(fù)EsxA28-36或EsxJKPW24-34在MHC-I上的呈現(xiàn)。這表明，這兩種肽段在MHC-I上的呈現(xiàn)依賴于ESX-1的活性，但獨(dú)立于下游的I型干擾素信號(hào)。

圖4 ESX-1活性是MHC-I上呈遞EsxA28-36和EsxJKPW24-34所必需的

四、Mtb肽在MHC-I上的呈遞依賴于抗原加工蛋白酶

許多MHC-I肽段由蛋白酶體進(jìn)行蛋白水解處理，而其他一些則由內(nèi)體或溶酶體蛋白酶處理。為了確定這些機(jī)制是否對(duì)MHC-I上Mtb肽段的呈遞有貢獻(xiàn)，使用蛋白酶體活性抑制劑（MG-132）、半胱氨酸蛋白酶活性抑制劑（E64d）和溶酶體酸化抑制劑（bafilomycin）來處理巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示Mtb肽在MHC-I上的呈現(xiàn)并未受到顯著影響。表明Mtb肽在MHC-I上的呈遞可能依賴于其他類型的抗原加工蛋白酶，或者存在多種冗余途徑共同參與這一過程。

圖5 抑制常規(guī)抗原加工蛋白水解途徑不會(huì)損害EsxA28-36和EsxJKPW24-34在MHC-I上的呈遞

研究結(jié)論

研究確定了幾種能夠在感染了Mtb的原代人巨噬細(xì)胞MHC-I上呈遞的Mtb蛋白，可以作為結(jié)核病疫苗的靶標(biāo)。通過顯示T7SS底物在巨噬細(xì)胞的MHC-I中被過度表達(dá)，并揭示Mtb抗原加工的機(jī)制決定因素。該研究促進(jìn)了該領(lǐng)域?qū)Y(jié)核病抗原呈遞的理解，并為結(jié)核病疫苗的開發(fā)提出了新的潛在靶點(diǎn)。