三陰性乳腺癌（TNBC）是復(fù)發(fā)率和死亡率最高的乳腺癌亞型，化療一直是其一線治療方法，但在轉(zhuǎn)移性TNBC中傳統(tǒng)化療藥物效果有限。進(jìn)入外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）具有免疫逃逸并定植發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶的潛力，尤其是具有干性的多個CTC集群（CTC簇）。一些介導(dǎo)細(xì)胞粘附和干性的糖蛋白能驅(qū)動CTC簇的形成，然而糖基化在CTC簇形成中的作用尚未完全闡明。

2023年9月，美國西北大學(xué)范伯格醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊對敲除特定基因的乳腺癌細(xì)胞糖蛋白唾液酸化水平進(jìn)行了糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)并驗證了ST6GAL1下調(diào)能引起CTC簇糖蛋白末端唾液酸化喪失，導(dǎo)致細(xì)胞以休眠的方式逃避化療發(fā)生轉(zhuǎn)移定植。糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)ST6GAL1的底物糖蛋白PODXL是對抗CTC簇化療逃逸與轉(zhuǎn)移的候選靶點。

【文章標(biāo)題】Dynamic Glycoprotein Hyposialylation Promotes Chemotherapy Evasion and Metastatic Seeding of Quiescent Circulating Tumor Cell Clusters in Breast Cancer

【發(fā)表期刊】Cancer Discovery

【影響因子】29.497

【發(fā)表時間】2023年9月

【發(fā)表單位】美國西北大學(xué)范伯格醫(yī)學(xué)院

研究策略

結(jié)果速遞

一、化療逃逸性CTC簇預(yù)示乳腺癌不良預(yù)后

對162名III-IV期乳腺癌患者進(jìn)行血樣采集，并在3個月后的放療評估時對其中一半患者再次采血。約半數(shù)二次采血的患者在兩次采血間隔接受化療。計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)量多與患者不良預(yù)后相關(guān)，化療患者CTC簇數(shù)量顯著增加，且CTC簇數(shù)量增加或穩(wěn)定高計數(shù)的患者預(yù)后更差（圖1C）。

圖1 化療與CTC簇的形成和α2,6-SA、ST6GAL1的丟失相關(guān)

二、CTC簇中α2,6-唾液酸化缺失與PAX治療相關(guān)

流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)CTC簇中α2,6-唾液酸（α2,6-SA）水平顯著低于單個CTC；化療或紫杉醇（PAX）治療后CTC簇中α2,6-SA水平特異性降低（圖1E）。使用人源性組織異種移植（PDX）模型發(fā)現(xiàn)PAX治療導(dǎo)致荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移增加（圖I,J）、CTC簇比例增加（圖1L）和α2,6-SA水平，即接骨木凝集素（SNA）信號降低（圖1M,N）。

三、α2,6-SA或ST6GAL1的缺失促進(jìn)CTC簇形成，導(dǎo)致PAX處理逃逸

懸浮細(xì)胞成團(tuán)實驗顯示低α2,6-SA化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞成簇（圖2A）。敲除介導(dǎo)細(xì)胞粘附的CD44后，細(xì)胞α-2,6-SA水平和ST6GAL1表達(dá)增加，ST6GAL1抑制腫瘤細(xì)胞成簇能力（圖2B）。

檢測人ST6GAL1 KO（ST6KO）腫瘤細(xì)胞（MDA-MB-231和PDX）和小鼠ST6KO腫瘤細(xì)胞（4T1）的糖基化蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)ST6KO MDA-MB-231細(xì)胞中糖蛋白α2,6-SA化完全消失，流式細(xì)胞術(shù)等方法平行檢測驗證了該結(jié)果（圖2B）。

PAX以劑量依賴的方式降低PDX CTC-092和MDA-MB-231細(xì)胞的α2,6-SA（圖2D），并在25 μg/mL的低劑量下促進(jìn)耐藥CTC-092細(xì)胞成簇（圖2E）。α2,6-SA低的細(xì)胞對PAX更為耐受（圖2F），表明α2,6-SA缺乏與細(xì)胞PAX抗性和/或逃逸有關(guān)，且對比其他化療藥物發(fā)現(xiàn)這種耐藥具有特異性。

圖2 α2,6-SA和ST6GAL1抑制細(xì)胞成簇并賦予細(xì)胞PAX敏感性

四、ST6GAL1缺失誘導(dǎo)CTC簇停留在靜止期（G0）以逃避化療

Ki-67染色顯示與單一CTC相比，CTC簇增殖能力減弱（圖3A,F,G），化療后G1-G0期的細(xì)胞增加更多（圖3D），且DNA含量與α2,6-SA含量正相關(guān)（圖3E,F）。RNA測序后的富集分析發(fā)現(xiàn)ST6KO細(xì)胞中細(xì)胞周期被抑制，干擾素反應(yīng)、細(xì)胞粘附、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和炎癥反應(yīng)上調(diào)（圖3H-J）。分析細(xì)胞生長和細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)ST6KO細(xì)胞的融合性生長速度延遲（圖3K），靜止期（G0）細(xì)胞比例增加（圖3M,N），形成的克隆更小。在競爭增殖試驗中，ST6WT細(xì)胞占優(yōu)勢，但低劑量PAX處理下ST6KO細(xì)胞占優(yōu)勢。低α2,6-SA CTC的乳腺癌患者無遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移生存期較差，ST6GAL1 mRNA、蛋白高表達(dá)患者預(yù)后均較良好。這些結(jié)果表明缺乏ST6GAL1的腫瘤細(xì)胞在G0期靜止，具有化療逃逸優(yōu)勢，能導(dǎo)致患者不良預(yù)后。

圖3 缺乏α2,6-SA和ST6GAL1與CTC簇的靜止有關(guān)

五、播種期CTC和播散性腫瘤細(xì)胞的α2,6-SA和ST6GAL1水平的動態(tài)變化

免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)單個CTC中ST6GAL1水平高于CTC簇，α2,6-SA水平低于原發(fā)腫瘤細(xì)胞和肺轉(zhuǎn)移灶，RNA測序印證了該結(jié)果。小鼠尾靜脈注射發(fā)現(xiàn)低α2,6-SA組細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移后均變?yōu)榱烁擀?,6-SA播散性腫瘤細(xì)胞（DTC）。

六、ST6GAL1的缺失促進(jìn)TNBC轉(zhuǎn)移定植

基于多個TNBC PDX腫瘤的聚糖譜鑒定出α2,6-SA高的M1和M3 PDX和α2,6-SA低的M2 PDX（圖4A）。與M1 PDX相比，M2腫瘤細(xì)胞生長速度較慢，但形成的簇大5倍（圖4B），自發(fā)肺轉(zhuǎn)移信號強度高108倍（圖4D）。在上述細(xì)胞中擾動ST6GAL1，發(fā)現(xiàn)α2,6-SA水平升高抑制細(xì)胞成簇（圖4F）。尾靜脈注射發(fā)現(xiàn)ST6KO細(xì)胞播散與肺轉(zhuǎn)移增加（圖4I），原位移植瘤發(fā)現(xiàn)ST6KO組的腫瘤起始時間延遲、生長較慢，ST6KO M2腫瘤細(xì)胞自發(fā)肺轉(zhuǎn)移更多（圖4L-N），且CTC，尤其是CTC簇更多。

七、ST6GAL1的缺失促進(jìn)跨內(nèi)皮遷移性轉(zhuǎn)移

尾靜脈注射、原位移植瘤發(fā)現(xiàn)低水平的ST6GAL1導(dǎo)致血液CTC簇增加、肺轉(zhuǎn)移增加和增殖能力降低（圖4N）?？鐑?nèi)皮遷移試驗發(fā)現(xiàn)ST6KO MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞遷移效率更高。以上結(jié)果表明ST6GAL1具有雙邊調(diào)節(jié)作用，即缺乏ST6GAL1減緩腫瘤生長，但促進(jìn)CTC聚集與肺轉(zhuǎn)移；ST6GAL1上調(diào)促進(jìn)腫瘤生長，但抑制腫瘤播散轉(zhuǎn)移。ST6GAL1在CTC中的短暫缺失使CTC的聚集與定植增加，而DTC中ST6GAL1的恢復(fù)使定植后腫瘤生長增加。

圖4 在PDX模型中，ST6GAL1抑制簇的形成并阻斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生

八、糖基化蛋白組學(xué)揭示ST6GAL1新α2,6-SA化底物

使用接骨木凝集素（SNA）結(jié)合MDA-MB-231 ST6WT和ST6KO細(xì)胞膜組分或全細(xì)胞裂解物中的α2,6-SA化蛋白并進(jìn)行糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖5A），共鑒定出217種互作蛋白，其中68個特征性N-糖肽屬于14種糖蛋白（圖5B），IP-WB實驗證明其中PODXL、CD97、ECE1、ALCAM1、ICAM1和CD44與ST6GAL1的相互作用（圖5C）。siRNA敲低發(fā)現(xiàn)下調(diào)PODXL、CD97、ECE1和ALCAM1能減少ST6KO腫瘤細(xì)胞的成簇，敲低PODXL的效果尤為顯著（圖5D-F）。

與單個CTC相比，CTC簇中PODXL的表達(dá)增加（圖5G）。ST6KO細(xì)胞中PODXL蛋白水平升高但mRNA表達(dá)不變。去唾液酸化的PODXL蛋白（dP）與ST6KO細(xì)胞的結(jié)合強于其他組合（圖5H）。這表明ST6GAL1介導(dǎo)的PODXL α2,6-唾液酸化可能負(fù)調(diào)控其穩(wěn)定性和/或抑制腫瘤細(xì)胞簇形成所需的蛋白質(zhì)結(jié)合活性。

圖5 糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示新的ST6GAL1 α2,6-SA化底物

九、靶向PODXL阻斷ST6GAL1缺乏和化療逃避所促進(jìn)的肺轉(zhuǎn)移

尾靜脈注射發(fā)現(xiàn)PODXL和ICAM1敲低可有效阻斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植和成簇（圖6A-C），抗PODXL抗體能達(dá)成同樣效果（圖6D-I,N）。這表明PODXL作為ST6GAL1新靶點在PAX治療中促進(jìn)靜止期CTC簇的形成和乳腺癌轉(zhuǎn)移。

圖6 靶向PODXL阻斷ST6KO或化療引起的轉(zhuǎn)移

研究結(jié)論

在乳腺癌中，由于ST6GAL1及其催化的α2,6-唾液酸化的缺失，CTC簇細(xì)胞處于靜止期（G0），轉(zhuǎn)移、定植及PAX化療逃逸能力增加，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示ST6GAL1糖基化底物PODXL有助于CTC成簇和轉(zhuǎn)移定植。針對PODXL的中和抗體能緩解紫杉醇治療耐藥。