先天性心臟?。–HD）是全球最常見(jiàn)的出生缺陷類(lèi)型，由于CHD的高發(fā)病率和高死亡率，在妊娠早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)CHD是預(yù)防和治療的當(dāng)務(wù)之急。診斷越早，預(yù)后越好，因此，產(chǎn)前檢測(cè)胎兒CHD對(duì)于最大限度地降低CHD胎兒的死亡率和改善預(yù)后是必要的。

2023年12月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院趙健元團(tuán)隊(duì)、復(fù)旦大學(xué)丁琛團(tuán)隊(duì)聯(lián)合婦產(chǎn)科醫(yī)院等研究機(jī)構(gòu)在EMBO Molecular Medicine發(fā)表了題為“Proteome profiling of early gestational plasma reveals novel biomarkers of congenital heart disease”的文章，通過(guò)對(duì)有或沒(méi)有CHD后代的早期妊娠孕婦進(jìn)行血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析，深入討論并揭示了潛在的致病機(jī)制，確定了早期妊娠血漿中預(yù)測(cè)胎兒先心病的一組生物標(biāo)志物。

文章題目：Proteome profiling of early gestational plasma reveals novel biomarkers of congenital heart disease

發(fā)表期刊：EMBO Molecular Medicine

影響因子：11.1

發(fā)表時(shí)間：2023年12月

研究策略

樣本選擇：文章選用兩個(gè)獨(dú)立患者隊(duì)列作為樣本來(lái)源，其中包括從復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院招募的138例（包含67例CHD組孕婦（嬰兒后來(lái)被診斷為CHD）和71例健康對(duì)照組孕婦（嬰兒健康），group1）；從中國(guó)福利院國(guó)際和平婦幼保健院招募的69例（37例CHD組孕婦（嬰兒后來(lái)被診斷為CHD）和32例健康對(duì)照組孕婦（嬰兒健康），group2），共計(jì)104例CHD孕婦組和103例健康對(duì)照組孕婦。所有樣本是在懷孕10-12周時(shí)采集血漿樣本。

技術(shù)手段：DIA蛋白組學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)

文章摘要：

1. 選取兩個(gè)隊(duì)列分別進(jìn)行蛋白組學(xué)檢測(cè)，并評(píng)估定量方法的穩(wěn)定性、結(jié)果一致性分析；

2. CHD蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與驗(yàn)證；

3. 建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型，挑選9種蛋白作為標(biāo)志物并進(jìn)行早篩模型的驗(yàn)證。

圖1：本研究工作流

研究結(jié)果

一、樣本和定量方法穩(wěn)定性等分析

基于數(shù)據(jù)獨(dú)立獲?。―IA）方法對(duì)兩組的所有樣本進(jìn)行LC–MS/MS分析，并分析所有血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。應(yīng)用這種穩(wěn)健的工作流程，文章在group1和group2中共鑒定了8624種和7049種蛋白質(zhì)（圖2C和D），平均量化的分別有2220個(gè)、1926個(gè)（圖2 B）。隨著樣本數(shù)量的增加，蛋白質(zhì)數(shù)量逐漸趨于平穩(wěn)，表明蛋白質(zhì)檢測(cè)覆蓋范圍廣、穩(wěn)定性好。在所有樣本中，對(duì)照組和CHD組的定量蛋白質(zhì)強(qiáng)度跨越8個(gè)數(shù)量級(jí)，前10個(gè)高豐度蛋白質(zhì)分別占數(shù)據(jù)集中所有血漿蛋白質(zhì)豐度的40%和39%（圖2F）。

圖2：血漿的研究概述和蛋白質(zhì)組學(xué)特征

二、血漿中CHD相關(guān)蛋白質(zhì)組檢測(cè)

主成分分析（PCA）顯示，兩組病例和對(duì)照組之間存在明顯差異，表明在妊娠早期，患有CHD胎兒的孕婦表現(xiàn)出與患有健康胎兒的孕婦不同的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)特征（圖3A和C）。第1組顯示對(duì)照組和CHD組之間有397種差異表達(dá)蛋白（DEP）,其中，在CHD組中檢測(cè)到184種顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)和213種下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖3B）。在第2組中，在對(duì)照組和CHD組之間鑒定出225個(gè)DEP,其中，CHD組有80種蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，145種蛋白質(zhì)顯著下調(diào)（圖3D）。為了進(jìn)一步分析母體血漿中蛋白質(zhì)改變的情況，文章使用基因本體論（GO）術(shù)語(yǔ)分析對(duì)兩組中的重要DEP進(jìn)行了注釋?zhuān)⒋_定了受胎兒CHD影響的生物學(xué)過(guò)程。在兩組中，CHD組中264個(gè)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)主要富集在氨基酸代謝、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體、肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)、Ras-MAPK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路中；相反，358種顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)與碳水化合物代謝、心肌收縮和心肌病密切相關(guān)（圖3E）。此外，為了了解各種上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)的分子途徑關(guān)系，揭示了每個(gè)途徑中的關(guān)鍵分子，對(duì)改變的蛋白質(zhì)進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析（圖3F）。這些結(jié)果表明，患有CHD胎兒的孕婦的母體血漿中表達(dá)了大量與胚胎器官發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，這與健康胎兒的血漿中表達(dá)的蛋白質(zhì)顯著不同，這些顯著改變的蛋白質(zhì)可能成為疾病的生物標(biāo)志物。

圖3：兩組中CHD與對(duì)照組血漿蛋白質(zhì)組的差異

三、兩隊(duì)列中CHD相關(guān)蛋白的表達(dá)一致性高

本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)隊(duì)列樣本中有8種CHD相關(guān)蛋白變化都一致，其中CHD組HSP90AA1、MDH2、MYL9和ACLY的蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組；CHD組的NSF、TPM1、SERPINE1和CFHR2的蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（圖4A）。這些結(jié)果表明，母體血漿表達(dá)的蛋白質(zhì)與心臟發(fā)育有關(guān)。此外，CHD和對(duì)照血漿之間74種蛋白質(zhì)水平的變化一致。在兩組中，總共有25種蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，49種蛋白質(zhì)顯著下調(diào)（圖4B）。文章進(jìn)一步分析了這74個(gè)DEP，發(fā)現(xiàn)25個(gè)上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與代謝、先天免疫反應(yīng)和細(xì)胞周期途徑，而49個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)主要涉及葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和血管相互作用等過(guò)程。這些途徑可能對(duì)胎兒心臟發(fā)育至關(guān)重要（圖4C和D）。

圖4：兩組患者的血漿蛋白質(zhì)組改變

四、CHD蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、驗(yàn)證

為了確定CHD病理的潛在驅(qū)動(dòng)因素，文章使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），選擇了大約2280個(gè)蛋白質(zhì)來(lái)生成蛋白質(zhì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)由10個(gè)蛋白質(zhì)模塊（M1-M10）組成（圖5A）。隨后，對(duì)12種臨床病理表型進(jìn)行分層聚類(lèi)及功能分析，分為以下三個(gè)表型簇：簇1，包括法洛四聯(lián)癥（TOF）、主動(dòng)脈狹窄（AS）、持續(xù)性動(dòng)脈干（PTA）、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（TGA）和右心室流出道梗阻（RVOTO），該簇與蛋白質(zhì)模塊4和8顯著相關(guān)，并富含碳水化合物代謝、谷胱甘肽代謝和免疫反應(yīng)；簇2，包括三尖瓣反流（TR）和房間隔缺損（ASD），該簇與蛋白質(zhì)模塊9和10顯著相關(guān)，并富集ECM受體反應(yīng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；簇3，包括肺動(dòng)脈狹窄（PS）、室間隔缺損（VSD）、持續(xù)性左上腔靜脈（PLSVC）、左心室流出道梗阻（LVOTO）和房室間隔缺損（AVSD），該簇與蛋白質(zhì)模塊2和3顯著相關(guān)，主要富集于心肌生長(zhǎng)、發(fā)育和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（圖5B）。為了進(jìn)一步研究不同集群中影響疾病發(fā)生的潛在因素，也做了PPI網(wǎng)絡(luò)的途徑，數(shù)據(jù)揭示了每種途徑中的關(guān)鍵分子，如淀粉酶α2A（AMY2A）、免疫球蛋白λ樣多肽5（IGLL5）、MYL9、整合素亞基α1（ITGA1）、RAB6A、RAS癌基因家族成員（RAB6A）和連環(huán)蛋白β1（CTNNB1）（圖5C）。這些關(guān)鍵基因可能將CHD與對(duì)照組區(qū)分開(kāi)來(lái)。

此外，文章研究了10個(gè)蛋白質(zhì)模塊和18個(gè)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，只有三個(gè)模塊（M2、M3和M6）與CHD病理表現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性。簇3（M2和M3）與血脂呈正相關(guān)，與甲狀腺激素呈正相關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，血脂和甲狀腺激素水平的升高可能是CHD的危險(xiǎn)因素（圖5D）。文章比較了對(duì)照組和不同CHD組妊娠早期婦女血漿中七種脂質(zhì)的濃度，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)也CHD病的主要危險(xiǎn)因素，表明血脂波動(dòng)可能與冠心病的發(fā)生有關(guān)。

接下來(lái)研究團(tuán)隊(duì)采用xCell根據(jù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)生成細(xì)胞型免疫富集評(píng)分，鑒定了與免疫（CD4 T細(xì)胞和NK細(xì)胞）或基質(zhì)（脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）特征相關(guān)的21種不同細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)CHD的發(fā)生伴隨著血脂、脂肪細(xì)胞和CD4T細(xì)胞的增加以及內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和周細(xì)胞的減少，這可能會(huì)進(jìn)一步損害心臟發(fā)育。

圖5：CHD血漿蛋白質(zhì)組與臨床表型及指標(biāo)的關(guān)系

五、基于機(jī)器學(xué)習(xí)的冠心病識(shí)別的生物標(biāo)志物組合

選取group1中的9種蛋白（鈣蛋白酶-5（CAPN5）、烯醇化酶磷酸酶E1（ENOPH1）、組蛋白H2A 1-C型（H2AC6）、HSP90AA1、導(dǎo)入蛋白亞基β-1（KPNB1）、MDH2、MYL9、radixin（RDX）和SAMHD1）的組合建立了機(jī)器學(xué)習(xí)模型，該模型在訓(xùn)練集中AUC為0.964（圖6A）。用group1中的其余數(shù)據(jù)用于測(cè)試數(shù)據(jù)集，其AUC值達(dá)到0.989（圖6D）；用group2的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，AUC值為0.963（圖6G）。這些生物標(biāo)志物組合的混淆矩陣和主成分分析的結(jié)果在對(duì)照組和冠心病組的分類(lèi)中顯示出相對(duì)較高的準(zhǔn)確性（圖6B，C，E，F(xiàn)，H和I），進(jìn)一步說(shuō)明了該分類(lèi)器的可靠性。

圖6：利用機(jī)器學(xué)習(xí)開(kāi)發(fā)生物標(biāo)志物組合來(lái)預(yù)測(cè)CHD

研究結(jié)論

文章對(duì)妊娠期間的血漿樣本進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法，鑒定并驗(yàn)證了一種包含九種蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物組合，這些蛋白質(zhì)可以作為母體檢測(cè)胎兒CHD的新型非侵入性生物標(biāo)志物。孕婦只需在妊娠早期提供2uL血漿進(jìn)行檢查即可獲知后代發(fā)生CHD的風(fēng)險(xiǎn)，更有助于醫(yī)療資源的科學(xué)合理配制。此外，這項(xiàng)工作為更深入地了解CHD的病因，進(jìn)而制定更好的治療策略提供了極具價(jià)值的蛋白質(zhì)組學(xué)資源。