細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作為液體活檢的新星，引起了人們的興趣，用以補充癌癥篩查的不準確性和組織活檢的侵入性。前列腺癌(PCa)是男性最常見的癌癥之一，而傳統(tǒng)的前列腺特異性抗原（PSA）檢測存在準確性和侵入性問題。為了克服這些限制，科學家們一直在尋找新的生物標志物。

近日，寧波大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科蔣軍輝教授團隊&澳大利亞新南威爾士大學李勇教授團隊，在《Advanced Science》上發(fā)表了一項題目為 “Proteomic Identification of Small Extracellular Vesicle Proteins LAMB1 and Histone H4 for Prostate Cancer Diagnosis and Risk Stratification”的突破性研究，通過無標記質譜技術對來自不同前列腺癌細胞系的小細胞外囊泡（sEVs）樣本進行蛋白質組學分析，以鑒定潛在的sEVs蛋白生物標志物，并通過PRM靶向蛋白質組學、WB和ELISA對來自不同前列腺癌階段的人血漿和尿液樣本進行驗證。該研究揭示了sEVs蛋白LAMB1和Histone H4作為PCa診斷和風險分層的潛在生物標志物。

研究策略

圖1：研究設計示意圖

結果速遞

一、LC-MS/MS鑒定PCa細胞系sEV蛋白潛在標志物

利用非標記定量蛋白質組學技術，對PCa細胞系（PC3、DU145、LNCaP和22Rv1）和正常前列腺上皮細胞系（RWPE-1）的sEVs，進行了深入研究，共鑒定到1570種蛋白，其中878種蛋白被定量，表現(xiàn)出在不同前列腺癌細胞系和正常前列腺上皮細胞中的表達差異。GO富集分析顯示，所有sEV樣本中，“細胞外外泌體”和“細胞外囊泡”成分豐富，這強調了sEVs及其在PCa中的重要作用。在所有五種細胞系sEVs中，發(fā)現(xiàn)了219種共有蛋白，133種sEV蛋白質僅在PCa細胞系中表達，5種sEV蛋白質僅在轉移性PCa細胞系中表達。在超過50%的PCa樣本中篩選出20種潛在sEV蛋白（在轉移性PCa細胞系sEVs中高表達，而在局部原發(fā)性PCa細胞系或正常前列腺上皮細胞系sEVs中表達缺失或極低）進行進一步驗證。

圖2：PCa細胞系sEV蛋白的分析

二、PRM和WB技術驗證不同階段PCa患者中潛在sEV蛋白

為了驗證PCa細胞系中潛在的sEV生物標志物，并評估其作為PCa患者診斷或風險分層標志物的潛力，對來自不同疾病風險和分期的臨床樣本（健康對照組n=12，低風險PCa患者n=12，高風險PCa患者n=12，轉移性mPCa患者n=12）進行了PRM靶向質譜分析。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的sEV LAMB1表達在高風險組和轉移性PCa組之間存在顯著差異，而尿液樣本中的sEV Histone H4表達在高風險組與低風險組、對照組和轉移性組之間也存在顯著差異。提示LAMB1和Histone H4可能是候選生物標志物。此外，sEV中包含大量非PCa細胞特異性蛋白質，這可能與生物樣本的來源有關。

通過WB進一步驗證了sEV蛋白LAMB1和Histone H4在PCa細胞系中的表達與蛋白質組學結果一致，但正常RWPE-1細胞與PCa細胞系中sEV蛋白表達存在顯著差異，這可能與不同細胞類型通過自分泌或主動分泌sEVs來調控鄰近或遠距離細胞的機制不同有關。此外，對人血漿和尿液樣本的WB分析進一步證實了這些發(fā)現(xiàn)，但僅部分驗證了LCMS/MS結果。但sEV蛋白在血漿和尿液中的表達水平不同，表明臨床樣本中sEV蛋白表達具有變異性。這些發(fā)現(xiàn)與PRM結果一致，為sEV蛋白LAMB1和Histone H4作為診斷標志物的進一步研究提供了依據(jù)。

圖3：用PRM和WB驗證PCa樣品中選定的sEV蛋白

三、Elisa驗證血液和尿液中sEV蛋白LAMB1和Histone H4

sEV蛋白在PCa診斷和分層中的潛在臨床應用。通過ELISA方法，在血漿和尿液樣本中分析了sEV蛋白LAMB1和Histone H4的表達水平，并與現(xiàn)有的血清PSA檢測進行了比較。結果顯示，LAMB1在mPCa患者中的表達顯著升高，其診斷準確性高于血清PSA。同時，Histone H4能夠區(qū)分低風險和高風險PCa患者，其診斷價值也高于血清PSA。此外，將LAMB1和Histone H4與血清PSA結合使用，可進一步提高診斷價值。這些結果提示，sEV蛋白LAMB1和Histone H4在PCa診斷和分層中具有潛在的臨床價值，并可能成為改進現(xiàn)有診斷方法的候選生物標志物。

圖4：PCa患者血漿和尿液中sEV蛋白LAMB1和Histone H4的臨床驗證

四、LAMB1和組蛋白H4蛋白在人前列腺癌組織中的表達及臨床相關性

通過免疫組織化學（IHC）染色法分析了人組織樣本，以進一步探討sEV蛋白在PCa中的臨床相關性。研究發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，PCa組織中LAMB1和Histone H4蛋白的表達均增加。進一步分析顯示，sEV LAMB1在血液中和Histone H4在尿液中的表達可能與PCa細胞分泌有關。此外，對手術期間獲取的PCa組織樣本進行分析發(fā)現(xiàn)，LAMB1蛋白在轉移組中的表達模式與其他組別存在顯著差異，且與血漿中sEV LAMB1的表達一致。然而，Histone H4在尿液sEV中的表達模式與PCa組織中的表達不一致，可能受其他因素影響。最后，通過cBioPortal數(shù)據(jù)集的分析，發(fā)現(xiàn)高表達的LAMB1和Histone H4與PCa患者的不良預后和低生存率相關，提示這兩種sEV蛋白在PCa的診斷、預后和治療中具有潛在價值。

圖5：LAMB1和Histone H4在臨床PCa組織中的臨床關聯(lián)

研究結論

該研究通過外泌體（sEVs）蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)了兩種具有高特異性和敏感性的蛋白標志物：LAMB1和組蛋白H4，為前列腺癌的診斷和風險分層提供了新的生物標志物。

參考文獻

[1] Pang B, Wang Q, Chen H, et al. Proteomic Identification of Small Extracellular Vesicle Proteins LAMB1 and Histone H4 for Prostate Cancer Diagnosis and Risk Stratification[J]. Advanced Science 2024 Apr 8: e2402509.